正畸力作用下大鼠炎性牙周组织中肝细胞生长因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞因子在牙周组织改建机制中具有重要的免疫调节和直接介导作用。目前肝细胞生长因子在正畸力作用后对牙周组织改建的作用及机制尚未见报道。
目的：探讨肝细胞生长因子在炎性牙周条件下参与牙移动及牙周改建的机制。
方法：选用30只8周龄雄性SD大鼠，建立牙周炎模型，随机分为2组，炎性对照组5只，炎性加力组25只。炎性加力组在上颌第一磨牙近中施加50 g的力值，分别在受力1，3，5，7，14 d处死，每次处死5只。采用苏木精-伊红染色、免疫组化方法分析牙齿受力移动不同阶段牙周组织中肝细胞生长因子表达和分布变化。
结果与结论：苏木精-伊红染色结果显示，受力牙齿与未受力牙齿牙周组织中都存在一定程度的改建。免疫组化结果显示，炎性对照组中可观察到肝细胞生长因子在牙周组织中呈阳性表达，分布较均匀。炎症加力组大鼠牙周组织内肝细胞生长因子受力后表达增高，在第5天达到高峰，之后开始下降；其中成骨细胞、成纤维细胞及破骨细胞均为强表达。提示肝细胞生长因子参与了正畸牙周组织的改建过程，其表达随时间呈现一定规律，炎症刺激可导致牙周组织中肝细胞生长因子的表达增高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 牙周炎, 正畸牙移动, 肝细胞生长因子, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: The cytokine has an effect of immunoregulation and immediate induction in the reconstruction of periodontal tissue. At present, the role and mechanism of hepatocyte growth factor involving the reconstruction of periodontal tissue under orthodontic force are still unclear.
OBJECTIVE: To explore the mechanism underlying hepatocyte growth factor in the tooth movement and periodontal tissues remodeling under the inflammation periodontal tissue condition.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats, aged 8 weeks, were used to establish periodontitis model. The obtained model was randomly divided into two groups: inflammatory control group and inflammatory force group. In the force group, rats were treated with the fixed orthodontic appliance by 50 g forces in the maxillary first molars. After 1, 3, 5, 7 and 14 days of tooth movement, five rats were sacrificed respectively. Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry methods were used to analyze the expression and distribution of hepatocyte growth factor in the periodontium for rats at different tooth movement stages.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results showed that, remodeling of periodontal tissues existed in all groups. The immunohistochemical results showed that hepatocyte growth factor had positive expression in periodontal tissue, and the distribution was even in the control group. In the force group, hepatocyte growth factor expression was increased and reached the peak on day 5, then began to decline. Osteoblast, fibroblast and osteoclast were strongly expressed. The findings indicate that, hepatocyte growth factor is involved in the periodontal tissues remodeling under orthodontic force, and inflammation can increase the expression of hepatocyte growth factor in periodontal tissue.

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Key words: periodontitis, hepatocyte growth factor, models, animal

中图分类号:

R318

刘红，米丛波，祝军.. 正畸力作用下大鼠炎性牙周组织中肝细胞生长因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2377-2382.

Liu Hong, Mi Cong-bo, Zhu Jun. Expression of hepatocyte growth factor in the inflammatory periodontal tissue of rats during orthodontic tooth movement[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2377-2382.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入30只SD大鼠，分为6组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 牙周局部检查结果

结扎2周后观察：大鼠较正常大鼠体质量减轻，双侧上颌第一磨牙的丝线结扎未脱落，牙龈呈暗红色，龈乳头和龈缘水肿，质地松软，探诊出血。

结扎4周后观察：双侧上颌第一磨牙丝线结扎完好，牙龈退缩，与牙面不贴附，牙龈可见龈缘黏膜糜烂、坏死，牙槽骨吸收明显，根面牙石形成，用探针可探及明显的牙周袋，探诊后牙龈易出血，牙齿Ⅱ度松动，临床诊断为牙周炎。

2.3 苏木精-伊红染色光镜观察结果

炎性对照组：镜下可见病理性牙周袋形成，牙槽骨吸收显著，龈沟上皮出现钉突、棘层增厚，袋壁处有大量炎症细胞浸润，除中性粒细胞以外，上皮下结缔组织内出现大量淋巴细胞，纤维结缔组织显著增生，牙周膜内牙周纤维有不同程度的断裂，水肿，骨组织界面可见吸收陷窝及破骨细胞，牙槽嵴顶及固有牙槽骨吸收破坏，牙槽峭高度降低，组织学观察提示牙周炎建模成功。

炎性加力组：加力后张力侧牙周间隙变宽，压力测牙周间隙缩窄，随着加力时间的延长，张力测牙槽骨表面可见成骨细胞和新骨沉积，压力测边缘形成骨吸收陷窝，牙周组织淋巴细胞浸润主要位于龈下结缔组织内，加力后大鼠第一磨牙与第二磨牙根分叉处牙槽骨均有不同程度的吸收，且牙周组织破坏、骨吸收程度较炎性对照组严重(图2)。

2.4 免疫组化观察结果

炎性对照组：炎性SD大鼠牙周膜破坏，牙槽骨吸收，在牙周组织中肝细胞生长因子均呈阳性表达，主要表达于牙周组织成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞胞核中(图3A)。

炎性加力组：炎性加力1 d组肝细胞生长因子在牙周组织中阳性表达量比炎症对照组有少量增加；加力3 d组，肝细胞生长因子主要集中在成纤维细胞中，成骨细胞及破骨细胞也可见表达；到5 d时，肝细胞生长因子开始在在牙周膜组织中出现强阳性表达；随着炎症刺激去除时间的延长，可发现7 d组肝细胞生长因子在牙周组织的表达强度逐渐减弱，到14 d时，牙周组织肝细胞生长因子阳性表达持续减少，成纤维细胞中可见散在的肝细胞生长因子表达，而成骨细胞及破骨细胞未见或偶有个别表达(图3B，C)。

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引言

牙周炎是由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病^[1] ，是最常见的口腔疾病之一，随着正畸治疗技术的不断发展，临床工作中常可见牙周炎患者要求进行正畸治疗，或在正畸治疗过程中由于口腔卫生的保持欠佳及黏结剂和带环的刺激而引发正畸患者的牙龈炎或牙周炎，正畸力作用于具有牙周炎症的牙，炎性牙周组织如何进行改建？弄清这一问题，对于临床指导牙周炎患者的正畸治疗和维护正畸患者的牙周健康至关重要。
牙周炎的病理改变是结合上皮在大量微生物和炎性刺激因子的存在下，出现增殖和根向迁移，牙骨质和牙槽骨之间的胶原纤维破坏，导致牙周袋的形成和牙槽骨的吸收。一般在临床上对牙周炎严重程度的评估多采用牙龈指数、牙周附着水平、探针深度、菌斑指数、龈沟出血指数等指标，但这些指标往往不能及时准确的反应牙周炎的进展情况。目前细胞因子对牙周组织的致炎作用已成为大多数学者研究的重点，有研究报道细胞因子可作为牙周炎诊断的一个新的客观指标^[2] 。
细胞因子是一种细胞外信号蛋白，通过自分泌和旁分泌的形式作用于靶细胞引起细胞与细胞之间的信号传递。正畸牙移动过程中参与牙槽骨改建的细胞因子有白细胞介素因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子等^[3-6] 。有文献研究报道，肝细胞生长因子在牙周袋的形成和牙槽骨改建的过程中起了重要的作用^[7] 。
肝细胞生长因子是由间充质细胞分泌的多效应细胞因子。研究发现，当牙周组织出现损伤或炎症时，肝细胞生长因子在局部被激活，合成增加。正畸牙移动早期是一个急性炎症反应的过程，也是一个牙周组织改建的过程。正畸牙齿受力后，激活各种细胞因子，参与牙周组织的信号通路^[8] 。肝细胞生长因子在正畸牙移动过程中炎性牙周组织中的表达及致炎机制尚未见报道。
基于此，课题通过建立大鼠实验性牙周炎模型、大鼠正畸牙移动模型，利用免疫组织化学方法，初步探讨大鼠正畸牙移动过程中肝细胞生长因子在炎性牙周组织中的表达情况，以及在炎性牙周条件下参与牙移动及牙周改建的机制，以期为临床中伴有牙周病患者的正畸治疗提供理论参考依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2009年8至11月在新疆医科大学基础实验中心完成。

材料：

实验动物：健康雄性8周龄SD大鼠30只，体质量 (200±20) g ，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号为：SCXK90(新)2003-001。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

按随机数字表法分为炎性对照组、炎性加力1 d、3 d、5 d、7 d、14 d组，每组5只，分笼饲养，自由摄食，适应性喂养1周后开始实验。炎性对照组只行牙周炎模型的建立，不进行牙周炎牙移动实验。

实验方法：　

牙周炎模型的建立：将30只SD大鼠麻醉后，腹部向上固定于鼠板上，牵出舌头，以防止窒息，在双侧上颌第一磨牙牙颈部结扎一号丝线。结扎丝线同时改正常饮水为10%高糖水，每天检查丝线1次，有脱落者及时重新结扎，4周后进行牙周炎的确认^[9](图1A)。

牙周炎牙移动模型的建立：将已成功建模的牙周炎大鼠，腹腔麻醉，仰卧固定在手术台上，将镍钛弹簧用正畸结扎丝固定在右侧上颌切牙和第一磨牙间，使弹簧拉伸，测力计测其对第一磨牙产生约50 g的近中向牵引力，形成上颌第一磨牙近中移动的动物模型，实验组大鼠分别在受力1，3，5，7，14 d处死，定期观察大鼠口内装置和口腔卫生情况^[10](图1B)。

上颌标本的制作：按预定的时间将实验大鼠深度麻醉后，固定在手术台上，打开胸、腹腔，暴露心脏，灌注针刺入左心室，建立一个左心室输入、右心耳排出的灌注通道，用200 mL的生理盐水冲出动物体内的血液，250 mL甲醛溶液灌注固定标本。灌注结束后，取出包含右侧上颌第一磨牙及其周围牙槽骨在内的组织块，甲醛固定标本 24 h，EDTA脱钙4周，脱水，浸蜡、包埋，沿颌骨及牙长轴矢状(近远中方向)切片，片厚约5 μm，苏木精-伊红常规染色及肝细胞生长因子免疫组化染色^[10]。

免疫组织化学染色：常规二甲苯脱蜡20 min，采用SABC免疫组织化学染色法，分别加入Bcl-2、Bax多克隆抗体行免疫组织化学染色^[11]，细胞阳性表达为棕色，每张切片于镜下随机选取5个视野，应用Motic Images Advaced 3.2图像分析系统对大鼠牙周组织中肝细胞生长因子的免疫组织化学检测结果进行图片采集与分析。

主要观察指标：苏木精-伊红染色观察牙周组织的改建情况，免疫组化观察肝细胞生长因子的表达规律。

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讨论

正畸牙移动的生理介质是牙周膜，它的生物力学反应起着至关重要的介导和调控作用^[12-16] 。正畸牙齿受力后，牙周膜组织表现为受压侧破骨细胞聚集、功能活跃，牙槽骨吸收；受牵张侧成骨细胞生成、行使功能，牙槽骨改建，骨形成^[17-23] 。这种牙周组织的变化可引起牙周化学环境的变化，激活各种细胞因子，如白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等参与牙周改建的信号通路。细胞因子是一种细胞外信号蛋白，引起细胞与细胞之间的信号传递，以激发牙周许多细胞的反应，使牙周组织改建，以形成一个新的骨沉积或吸收的微环境。
越来越多的实验证明，细胞因子在牙周组织的改建机制中起到重要的免疫调节作用和直接介导作用^[24] 。细胞因子是体内多种细胞产生的一大类糖蛋白。牙周组织周围存在一个复杂的细胞因子网络，细胞因子之间相互调节，相互影响，保持着牙周组织的正常形态和功能，当炎症存在时，细胞因子之间的平衡被打破，某些细胞因子分泌会增多，从而引起全身或局部的病理反应。牙周组织中含有许多细胞因子，它们在口腔炎症的发生发展中有重要意义，因此，国内外学者们目前注重从细胞因子出发，探讨它们在牙周炎的发病机制中的作用，希望使它们成为牙周炎诊断、指导治疗、判断疗效、确定或预测牙周炎活动性破坏的客观指标。
肝细胞生长因子是20世纪70年代中期发现的一种新型生物活性物质，由间充质细胞分泌所产生的多效应细胞因子，如内皮细胞、上皮细胞、肺癌细胞和肾小球系膜细胞等，具有促进细胞分裂，调节细胞生长与迁移、抗细胞凋亡、促进血管内皮细胞增生和新生血管形成、抑制肿瘤细胞生长、营养神经等作用。近年来研究发现，牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞也可以分泌产生肝细胞生长因子^[25] 。特别是在炎症状态下，肝细胞生长因子含量增高，且与白细胞介素1、白细胞介素6、前列腺素E2、肿瘤坏死因子a等呈剂量依懒性，因此肝细胞生长因子水平可反应牙周组织的炎症破坏程度，在判断牙周组织的活动性破坏中有重要意义。
3.1 肝细胞生长因子与牙周组织指数有研究报道，牙周炎患者的龈沟液中，牙周临床指数与肝细胞生长因子的含量呈正相关^[7] ，牙周炎经治疗后，龈沟液中肝细胞生长因子水平相应降低，指出肝细胞生长因子水平可以作为反映及评价牙周治疗疗效的一个客观指标，在判断牙周组织的活动性破坏中有重要意义。
Kakimoto等^[26]研究表明牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞可分泌产生肝细胞生长因子，肝细胞生长因子可以提高提高牙龈上皮细胞的活性，在牙周袋形成和牙槽骨吸收的病理过程中起到了重要的作用。陈建洪等^[27]通过对15例慢性牙周炎患者30个牙位牙周治疗前后龈沟液分析发现，治疗前龈沟内肝细胞生长因子含量和牙龈出血指数较高，治疗后，肝细胞生长因子水平下降，且牙周指标中的出血指数明显下降。本文中随着牙周炎症状的减轻和牙移动时间的延长，大鼠牙周出血情况明显好转，肝细胞生长因子在牙周组织的表达量也随之下降，与上述实验结果一致。推断可能原因是在牙周出现炎症时，牙龈内皮细胞破坏，肝细胞生长因子是一种血管生成的强大诱导剂，通过自分泌或旁分泌的形式与受体c-MET结合，激活酪氨酸激酶，刺激内皮细胞形成血管样结构，参与内皮细胞损伤的修复机制。
3.2 肝细胞生长因子的炎症介导信号通路牙周炎是细菌感染性疾病，许多细胞因子参与了在炎性渗出及牙槽骨的破坏，本文中，牙周炎和正畸牙移动均能刺激肝细胞生长因子的产生，肝细胞生长因子参与了牙周组织的改建。分析其可能的机制是肝细胞生长因子最初是以非活化的形式分泌，当有牙周炎症产生或牙齿移动受力后时，肝细胞生长因子在激活剂肝细胞生长因子激活因子的作用下转化为活性分子，能刺激破骨细胞和成骨细胞产生c-MET 受体，并与受体结合激活该受体的酪氨酸激酶活性产生磷酸化，从而与一些细胞内效应蛋白结合发挥生物学效应，从而促进结合上皮的根向迁移，加快炎症的发展^[28] 。
3.3 正畸牙移动对大鼠炎性牙周组织改建的影响本文发现，牙周炎大鼠在接受正畸力后，牙齿移动速度较快，牙周及根尖创伤较大，张力侧成骨活动减弱滞后，牙周组织改建缓慢。说明牙周炎会导致牙齿移动距离加快，并影响牙周组织的正常改建。提示医生一定要重视局部牙周组织的生理及病理状态，对牙周炎患者进行正畸治疗时，应在去除菌斑、牙结石后，牙周炎症得到控制的情况下，才能给予正畸治疗，并且在正畸牙移动中应避免炎性物质对牙周组织的侵袭，并适当延长复诊周期，以促进牙周组织的愈合和改建，这样才不会损伤牙周组织，否则可能会导致牙周组织的严重破坏，给正畸治疗带来不利影响^[29-32] 。
3.4 正畸牙齿移动过程中肝细胞生长因子在炎性牙周组织表达规律从免疫组化结果可以看出，炎性对照组大鼠牙周组织中成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞胞核中肝细胞生长因子呈阳性表达，大鼠磨牙在受到近中向的正畸牵引力后，肝细胞生长因子表达水平进一步提升，5 d组达到峰值，并在较长的观察时段内维持较高水平，分析原因可能是加力初期，牙周炎症未控制，牙周组织内的大量微生物和炎性刺激因子可刺激肝细胞生长因子的产生，出现牙龈结合上皮的增殖和根向迁移，牙骨质和牙槽骨之间的胶原纤维破坏，导致牙周袋的形成和牙槽骨的吸收；但肝细胞生长因子表达量在7 d组有所下降，破骨活性降低，14 d组继续下降，分析原因可能是一方面随着致炎因素(停止高糖饮水及丝线结扎)的去除以及大鼠自身具有的良好口腔自洁功能，原有炎症消退较快，另一方面随着加力时间的延长，镍钛拉簧的力值有所衰弱，且大鼠牙周组织逐渐适应了矫治力，肝细胞生长因子上调反馈性的引起成骨细胞增加肝细胞生长因子合成，使牙周组织中肝细胞生长因子mRNA表达相应增多，起到部分抑制破骨作用。肝细胞生长因子不仅参与了牙周组织生理改建，其表达变化也反映牙周炎症的病变进程。
3.5 肝细胞生长因子在口腔疾病中的研究前景肝细胞生长因子是20世纪70年代中期发现的一种新型细胞因子，具有广泛的生物学作用，在牙周炎的发生和发展中发挥了重要作用，因此，若能通过各种途径对肝细胞生长因子的产生及其生物学效应的发挥进行有效的调控，就可以减轻其对牙周组织的损害，这将会对临床的治疗有积极的意义^[33-42] 。
由于受课题经费及时间的影响，本课题仅局限于对肝细胞生长因子在牙周组织中表达水平的研究，对于基因水平的研究以及大鼠正畸牙移动周期中肝细胞生长因子与各种相关炎性细胞因子之间的相互作用等方面尚未涉及，希望以后在科研工作中对肝细胞生长因子做更深层的研究，但可以预见，随着认识的不断深化，肝细胞生长因子将在牙周改建、口腔组织发育等方面有着广阔的应用前景。

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